محیط کشت باکتری‏ها
به منظور کشت باکتری‏ها، در تمامی موارد از محیط کشت LB به‏صورت جامد و مایع استفاده شد. تریپتون، عصاره مخمر، سدیم کلراید و آب ترکیباتی هستند که در تهیه‏ی LB مایع مورد استفاده قرار می‏گیرند، با افزودن آگار به محیط LB مایع، حالت جامد از محیط مذکور بدست می‏آید. محیط کشت به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱درجه سانتیگراد اتوکلاو شد. در صورت نیاز به آنتی بیوتیک، بعد از اینکه دمای محیط کشت اتوکلاو شده به زیر ۵۰ درجه سانتی گراد رسید، آنتی بیوتیک لازم به صورت استریل به محیط اضافه شد(سمبروک و راشل،۲۰۰۱).
آنتی‏بیوتیک‏ها
با بهره گرفتن از روش‏های استاندارد، آنتی‏بیوتیک‏های مورد استفاده با غلظت مناسب تهیه و در میکروتیوب‏های ۵/۱ میلی لیتری تقسیم‏بندی گردید و در ۲۰- درجه سانتی‏گراد نگهداری شد. آنتی‏بیوتیک آمپی‏سیلین (mg/ml 75) به‏عنوان نشانگر انتخابی برای پلاسمیدهای pGEM7zf(-) و همچنین pUCI9 و کانامایسین (mg/ml 50) برای پلاسمید pBI121 مورد استفاده قرار گرفت، به‏علاوه به منظور گزینش آگروباکتریوم نیز از آنتی‏بیوتیک ریفامپسین (mg/ml 75) استفاده شد.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

برای تهیه محلول‏های مادری آنتی‏بیوتیک، معمولاً از آب استریل استفاده شد که بعد از حل کردن پودر آنتی‏بیوتیک‏ها، در شرایط استریل فیلتر (فیلتر ۲۲/۰ میکرومتر) می‏شوند. حلال ریفاپسین برخلاف آمپی‏سیلین و کانامایسین که آب می‏باشد، متانول است که در آن صورت نیازی به فیلتر ندارد. پلیت‏های آنتی‏بیوتیک تا یک هفته قابل نگهداری در یخچال می باشند (سمبروک و راشل،۲۰۰۱).
طراحی آغازگر^[۵۹]
برای انجام مراحل مختلف تکثیر و یا تاییدهای مولکولی بر مبنای PCR و تعیین توالی، آغازگرهای اختصاصی طراحی شدند. آغازگرهای اختصاصی hrpW و hrpG برای تکثیر و جداسازی دو ژن مورد نظر از ژنوم باکتری xcc به گونه‏ای طراحی شدند که آغازگرهای رفت علاوه بر پوشش چند نوکلئوتید ابتدای ژن به همراه کد آغازین در انتهای ‘۵ خود دارای سایت برش XbaI و همچنین ۲ نوکلئوتید اضافه بر آن بعنوان Overhang می‏باشد، اما در مورد آغازگرهای برگشتی دارای جایگاه‏های برش مختلف هستیم، به گونه‏ای که در آغازگر برگشتی مربوط به hrpW سایت SacI و در مورد آغازگر برگشتی hrpG جایگاه BamHI قرار می‏گیرد، علاوه بر این همچنین آغازگر برگشتی hrpW دارای کدون خاتمه بوده در صورتی که این کدون در آغازگر برگشتی مربوط به hrpG به جهت حفظ و بیان gus در وکتور بیانی، حذف شده است. ویژگی‏ها و ساختارهای ثانویه احتمالی تمامی آغازگرها با کمک نرم افزار Oligo7 بررسی شد و بهترین ترادف‏ها سفارش داده شدند.
ترادف آغازگرهای به‏کار رفته در این تحقیق در جدول زیر آمده است. لازم به ذکر است که علاوه بر دو جفت پرایمر مذکور از دو جفت پرایمر دیگر تحت عنوان Xac01 و Xac02 و همچنین MS⁺ وMS^- گرفته شده از منابع علمی موجود در راستای شناسایی باکتری مورد مطالعه، جهت تایید A* بودن و در نتیجه گزینش باکتری هدف از بین کلکسیون باکتری‏های زانتوموناس در قالب پاتووارهای مختلف، موجود در مرکز ملی مهندسی ژنتیک بهره گرفته شد. سنتز پرایمر‏ها توسط شرکت تکاپوزیست صورت پذیرفت.
جدول۱-۲- مشخصات آغازگر‏های اختصاصی برای تکثیر و شناسایی